Изучение явления анабиоза
в историческом аспекте

Известно, что большое число микроорганизмов, насекомых, мелких холоднокровных животных и представителей растительного мира, оказываясь в неблагоприятных для них условиях жизни, могут впадать в состояние анабиоза. В этом состоянии «мнимой смерти», на грани жизни и смерти, этим организмам удается таким уникальным способом сохранить жизнь в течение суровых зим или в летние засухи и жару.
Анабиоз — явление, характерное не только для микроорганизмов. Оно определенным образом связано с периодическим состоянием зимней спячки и у высокоорганизованных животных. Известно, что в зимнюю спячку впадают многие животные с постоянной температурой тела (ежи, суслики, летучие мыши, сурки и др.), а также многие виды животных с непостоянной температурой тела (ящерицы, лягушки, змеи, черепахи и др.). которые проводят зиму, зарывшись в ил, грязь или в землю, спрятавшись под опавшие листья, под кору деревьев и т. п. Там они находятся в неподвижном состоянии оцепенения, в условиях крайне пониженной жизнедеятельности.
Когда в 1705 г. (1) знаменитый голландский ученый-самоучка Антони ван Левенгук случайно поместил под сконструированный им микроскоп высушенный песок, взятый из желоба около водосточной трубы на крыше его дома, он с удивлением заметил, что, после того как песок был увлажнен, произошло нечто необычайное — высохшие в нем микроорганизмы, выглядевшие погибшими, начали двигаться, то есть «оживали». Это были невидимые простым глазом микроскопические черви — красные коловратки (Philodina roseola).
Чтобы удостовериться в том, что эти микроорганизмы действительно находятся в песке, Левенгук в последующих опытах доливал только кипяченую воду. А чтобы убедиться в том, что коловратки могут «воскресать» после длительного периода времени, он сохранял горсть песка, взятого из желоба крыши, в течение 21 месяца в сухом месте. После того как этот песок смочили водой, коловратки снова ожили. Изучая биологическое состояние высушенных и увлажненных коловраток, Левенгук пришел к выводу, что они обладают большой устойчивостью к высыханию.
Левенгук считал, что коловратки защищены оболочкой, которая не позволяет влаге полностью испариться из их организма. Он не допускал возможности сохранения жизни у существа, полностью утратившего влагу своего тела. Изобилие организмов во временно образовавшихся лужах он тоже объяснял их свойством оставаться живыми, хотя и высушенными в тине пересохшей лужи.
В 1743 г. английский ученый Нидхем наблюдал подобное же странное явление в зернах пшеницы, зараженных пшеничной нематодой — Tylenchus tritici — мелким круглым червем. Его личинки оказались способны сохраняться более двух лет в так называемых галлах даже в высушенных зернах пшеницы. Попав вместе с зернами в почву, галлы впитывали влагу, при этом личинки пшеничных нематод восстанавливали свою жизнедеятельность и выходили в почву. После того как пшеница выколосится, личинки добираются до цветочных почек, где и наступает их половая зрелость. Самки откладывают яйца, снова вылупляются личинки, и весь цикл повторяется. Заболевание, вызываемое пшеничной нематодой, было известно, хотя его причины оставались неразгаданными. Чтобы выяснить их, Нидхем взял темно-коричневые зерна из зараженного колоса, размолол их и положил под микроскоп. В поле зрения он наблюдал неподвижных личинок, которые оживали после того, как их смачивали каплей воды. Нидхем сохранял личинок восемь недель живыми в воде, после чего снова их высушил. Поместив их через некоторое время в воду, он снова их оживил. Эти опыты повторялись неоднократно, но результат был один и тот же. Больше того, после двухгодичного хранения в сухом состоянии личинки снова «оживали». Нидхем считал, что личинки погибают при высыхании, а при увлажнении снова оживают. Позже он пришел к выводу, что высушенные пшеничные нематоды обладают особенной жизнестойкостью, отличающейся от нормальной. Помещенные в воду, эти организмы могли перейти в состояние нормальной жизни (2).
В 1777 г. итальянский ученый аббат Ладзаро Спалланцани (получивший впоследствии всемирную известность благодаря своим знаменитым опытам по изучению способности летучих мышей ориентироваться в пространстве) подтвердил наблюдения Левенгука. Спалланцани исследовал возможность оживления высушенных красных коловраток филодиний после их пребывания в условиях высокой (+49°C) и низкой (—21°С) температур, установив при этом, что они переносят ее и оживают сразу же после создания для них благоприятных условий. Опыты с активными коловратками показали, что они погибают уже при температуре 35 — 36°С.
При изучении коловраток филодиний в песке, взятом из желоба на крыше, Спалланцани обнаружил после его увлажнения новое водное шестиногое животное микроскопических размеров, которое назвал Tardigrada (по-лат.— «тихоходка»), поскольку его движения были очень медленны. Это название обнаруженных пресноводных обитателей мхов и лишайников сохранилось в науке и до сих пор.
При изучении биологических особенностей тихоходок Спалланцани установил, что и они, как и коловратки, способны переносить высушивание и оживать после того, как их увлажнят. Его наблюдения показали, что при высушивании жизнедеятельность тихоходок постепенно прекращалась, ножки втягивались в тело, объем уменьшался, и они превращались в шарики. Процесс их оживления после добавления воды проходил тоже постепенно — тело, впитав влагу, приобретало свой первоначальный объем, жизненные функции восстанавливались, и животные становились подвижными. Устойчивость тихоходок к высокой и низкой температуре оказалась такой же высокой, как и у коловраток. Спалланцани установил, что даже после одиннадцатикратного высушивания некоторые из них оживали.
Интересно, что еще на заре возникновения микробиологии — науки о микроорганизмах, которые нельзя наблюдать невооруженным глазом, пионеры микробиологической науки заметили, что огромная устойчивость этих организмов к высыханию связана не только с биологическими особенностями их строения, но и со свойствами той среды, в которой они находятся в высушенном виде.
Так оформились три точки зрения на причины устойчивости организмов к высушиванию: Левенгук считал, что коловратки защищены своей оболочкой, не позволяющей влаге полностью испариться. Он не допускал возможности сохранения жизни у существ, которые полностью потеряли влагу при высыхании. Нидхем же считал, что высохшие коловратки сохраняют жизнь, протекающую по законам какого-то особого тайного способа жить без наличия в их организме воды и без кислорода, содержащегося в воздухе. Точка зрения Спалланцани сводилась к тому, что жизнь коловраток, тихоходок (группа организмов, к которым относится и открытый им же Macrobiotus) и нематод пшеницы при высушивании прекращается, но после добавления воды снова возникает, и организмы как бы воскресают.
Несмотря на то что взгляды Нидхема и Спалланцани страдали метафизичностью, все же их исследования сыграли важную роль в изучении явлений, связанных с жизнью и смертью этих микроскопических организмов.
Эти интересные явления привлекли к себе внимание многих исследователей. Были предприняты многочисленные попытки выяснить их сущность. Так, в 1842 г. французский ученый Дуайер подтвердил наблюдения Спалланцани о необычайной способности тихоходок сопротивляться высушиванию, а Давен в 1859 г. тщательно изучил нашумевший вопрос об оживлении личинок пшеничных нематод, сохранявшихся годами в зернах пшеницы. В то же время М. Гаварре после многочисленных опытов подтвердил необычайную устойчивость коловраток, тихоходок и пшеничных нематод к высушиванию в естественных условиях, так же как и при экспериментальном простом высушивании и при высушивании в условиях вакуума над серной кислотой, что приводило к быстрому поглощению влаги. М. Гаварре установил, что после высушивания эти микроорганизмы выдерживают нагревание до 110°С и, погруженные в воду, снова оживают.
В качестве оппонента всех этих исследований выступил французский ученый Феликс Пуше, который на основе своих опытов и наблюдений придерживался той точки зрения, что при полном высыхании коловраток и тихоходок они не могут оживать после добавления воды и что их жизнь не может быть восстановлена после воздействия кипящей водой.
В 1859 — 1860 гг. возник спор по вопросу об оживлении этих организмов между французскими учеными Феликсом Пуше и Дуайером.
Пуше не отрицал мнения Дуайера, Давена, Гаварре, утверждавших, что некоторые высушенные организмы могут оживать, но считал, что в этих случаях не было полного высыхания. По его мнению, полностью высушенные коловратки, тихоходки и нематоды, живущие во мхах, были не в состоянии оживать. Свои взгляды он тоже подкреплял опытами. Разрешением спора занялось Парижское биологическое общество. Оно создало специальную комиссию из видных ученых во главе с Броком, которой предстояло разрешить этот спор. Комиссия проверила опыты Дуайера и Пуше и поставила свои опыты, с помощью которых доказала, что в условиях вакуума организмы могут быть полностью высушены и выдержать потом пятиминутное нагревание до 100°С и при этом сохраняли способность оживать после добавления воды.
Комиссия повторила опыты Пуше по высушиванию коловраток на стекле под воздействием солнечных лучей и других атмосферных воздействий на протяжении трех месяцев. Результаты показали, что коловратки после добавления воды действительно не оживали. Однако комиссия отметила, что их гибель во время этих опытов наступила не в результате высыхания, а в связи с неустойчивым воздействием внешних условий, в которых они находились во время проведения опытов. Таким образом, возражения Пуше не подтвердились, и вывод о необычайной устойчивости коловраток, тихоходок и нематод к полному высушиванию и воздействию в таком состоянии высоких температур больше не встречал возражений. В конечном счете комиссия выступила в защиту приверженцев Дуайера.
Несмотря на это, энтузиазм Феликса Пуше нисколько не остыл, и в 1866 г. он провел новые интересные эксперименты по изучению воздействия низких (—17°С и —20°С) температур на различные виды рыб, моллюсков, инфузорий и бактерий и установил, что холод действует на них пагубно (за исключением бактерий).
Против его утверждения на сей раз выступил Пикте, который выдвинул следующую точку зрения: некоторые животные с непостоянной температурой тела могут оживать после полного их замораживания. Он провел опыты с замораживанием бактерий и их спор, диатомовых водорослей, коловраток и других мелких организмов в результате их охлаждения до температуры —200°С и установил, что после размораживания они продолжали жить. Пикте поддержал предположение, что чем примитивнее организм, тем легче он переносит воздействие низких температур.
Все большее внимание многих естествоиспытателей было привлечено к этому интересному и необъяснимому в то время явлению «воскресения» животных и растительных организмов, которые подвергались высушиванию или замораживанию. Но это явление все еще не имело наименования. В 1873 г. немецкий ученый Вильгельм Прайер предложил обозначить его термином «анабиоз». Так он называл все случаи безжизненного состояния организмов, при которых они не теряли жизнеспособности. А само состояние, в которое впадали коловратки, тихоходки и пшеничные нематоды,— именно над ними он проводил свои опыты, — Прайер предложил называть анабиотическим.
В 1883 г. немецкий исследователь Е. А. Шульц серией точных экспериментов доказал, что в живущих во мхах микроскопических организмах, названных им макробиотусами (Macrobiotus huffelandii), при высыхании прекращается всякая жизнедеятельность, возобновляющаяся после добавления воды.
Некоторые экземпляры удалось оживить даже после их пребывания в высушенном состоянии в течение четырех лет.
Проблема анабиоза стала рассматриваться на строго научной основе лишь в начале XX в. Тот факт, что некоторые организмы могут высыхать, а затем оживать снова, стал уже широко известен. Что же, однако, происходило с высыхающим организмом? Действительно ли в нем прекращалась жизнедеятельность или только сильно затормаживалась? Какие виды животных и растительных организмов могут впадать в анабиоз?
В XX в. содержание понятия «жизнь» стало более определенным. Жизнь — это обмен веществ между высокоорганизованной живой материей и окружающей средой. Действительно ли этот обмен веществ прекращается при высыхании организмов? Может ли он полностью прекратиться и затем снова восстановиться?
Бесспорно, что на эти вопросы ученые могли ответить лишь после углубленных исследований.
Значительный вклад в разъяснение проблемы анабиоза внес крупный русский ученый профессор Порфирий Иванович Бахметьев, проводивший все свои исследования в Болгарии, что делает честь болгарской науке и вызывает нашу законную гордость. На научных публикациях П. И. Бахметьева, независимо от того, на каком языке они были напечатаны, всегда указывался адрес: Софийский университет — Болгария. Таким образом П. И. Бахметьев утвердил за границей имя и авторитет болгарской научной мысли.
П. И. Бахметьев родился в русском селе Лопуховка Саратовской губернии, в 1860 г., в семье крепостного крестьянина. После окончания гимназии в Саратове любознательный юноша отправился в Швейцарию и получил физическое образование в Цюрихском университете. Так как он проявил себя как талантливый физик, его сразу же сделали ассистентом, а вскоре и приват-доцентом. В 1890 г. ему предложили возглавить кафедру физики на основанных в 1884 г. Высших педагогических курсах в Софии, переименованных в 1894 г. в Высшее училище, а в 1904 г. — в Софийский государственный университет. На это предложение молодой ученый отозвался с готовностью и стал в Болгарии первым профессором физики. Но его интересы не ограничивались только этим предметом. Большую часть своей научно-исследовательской деятельности он посвятил биофизике и биологии.
С помощью собственноручно изготовленного электрического прибора (термопара в виде иглы, соединенная с гальванометром) Бахметьев проводил опыты по изучению температуры насекомых в связи с внешними условиями, состоянием покоя и анабиоза. Этот прибор он назвал «электрический термометр» (обыкновенным термометром невозможно измерять температуру насекомого). Результаты этих исследований были опубликованы в 1899 г.
Наибольшую известность среди биологов П. И. Бахметьев снискал своими работами о «мнимой смерти», т. е. об анабиозе насекомых при замораживании. Этому он посвятил значительную часть своего времени и вел со многими биологами оживленные дискуссии. В анабиозе П. И. Бахметьев видел возможность продления человеческой жизни. Этой проблеме он посвятил свыше 25 научных публикаций. Бахметьев искал закономерности в реакции жидкостей тела на перемену температуры и в отражении этой перемены на состоянии и жизнеспособности всего организма. По этим вопросам он прочел много лекций, которые вызвали большой интерес в Болгарии и других странах.
П. И. Бахметьев первым начал строго научно изучать состояние организма насекомых при замораживании. С помощью своего уникального электрического термометра он определял температуру тела насекомых, помещенных в холодную камеру с температурой от —12 до —22°. Бахметьев впервые выявил интересное состояние насекомых при замораживании. Температура тела бабочки, помещенной в холодную камеру, сначала постепенно понижалась до — 10°С, потом начинала быстро повышаться до —1,5°С, после чего снова постепенно понижалась до —10°С. Это необычайное явление П. И. Бахметьев назвал температурным скачком.
В чем заключалась суть дела? При понижении температуры до —10°С жидкости тела насекомых превращались в кристаллы, причем у замораживаемых организмов выделялась скрытая теплота. Вследствие этого температура их тела повышалась до такой температуры, при которой жидкости замерзают без предварительного переохлаждения. Эта температура обычно удерживается ниже 0°, потому что в жидкостях тела содержатся растворенные соли. Температура эта настолько ниже 0°, насколько выше концентрация раствора. Так объясняется это необычайное явление, называемое П. И. Бахметьевым температурным скачком.
Изучая явления переохлаждения, а затем постепенного замораживания жидкостей тела бабочек, П. И. Бахметьев установил, что вскоре после «температурного скачка» насекомое могло ожить, если его извлечь из холодной камеры, несмотря на то что оно уже было заморожено, находилось в затвердевшем состоянии и выглядело мертвым. Это привело П. И. Бахметьева к мысли,
что в таких условиях в природе насекомые находятся в состоянии анабиоза. В подобном состоянии их нельзя считать живыми, поскольку процессы обмена веществ в их замерзшем теле почти прекратились, но они не умерли, так как если их согреть, то они снова оживают.
Позже, в 1912 г., П. И. Бахметьев продолжил свои исследования анабиоза, но на этот раз у млекопитающих. В качестве экспериментальной модели он избрал летучую мышь, которая впадает в зимнюю спячку. Первый опыт был проведен в феврале того же года. Летучую мышь перевязали тюлем, поместили в небольшую банку, чтобы она могла двигаться, в задний проход вставили термометр и поместили банку в холодную камеру при температуре —22°С. Начались наблюдения. Температуру летучей мыши записывали каждую минуту. В начале опыта (в 1 ч 56 мин ночи) ее температура была +26,4°С (в комнате + 12°С), через две минуты температура стала +23°С и потом начала быстро понижаться. К 2 ч 26 мин она достигла 0°С. Потом температура опустилась ниже 0°С и медленно понижалась. За 18 мин она снизилась, от 0 до —2,5°С, но затем продолжала падать быстрее. Когда тело летучей мыши охладилось до —4°С, П. И. Бахметьев вынул ее из холодной камеры. Тело оказалось совершенно твердым и не подавало никаких признаков жизни. При дуновении сверху на крыльях образовался иней. Постепенно крылья начали как бы отмокать и появились дыхательные движения. Летучая мышь ожила и прожила в доме ученого еще несколько недель, после чего умерла.
После этого опыта П. И. Бахметьев провел еще несколько экспериментов с летучими мышами, оказавшимися очень подходящим объектом, так как температура их тела и в природных условиях изменяется в широком диапазоне. Он был убежден, что подобным образом может добиться анабиотического состояния и у других видов млекопитающих, обладающих более совершенным физиологическим механизмом регулирования своей температуры тела. Известно, что у млекопитающих, которые не впадают в зимнюю спячку, температура тела даже после искусственного охлаждения не может сильно понижаться. П. И. Бахметьев, однако, возлагал надежды на открытие французского физиолога Дюбуа, который нашел способ частичного превращения млекопитающих из животных с постоянной температурой в животных с переменной температурой тела после вдыхания кислорода и углекислого газа. Дюбуа исходил из того обстоятельства, что во время зимней спячки в крови у спящих животных повышается содержание углекислого газа. Он давал кроликам (они не впадают в зимнюю спячку) вдыхать углекислый газ, смешанный с кислородом, и кролики впадали в продолжительный сон, как только температура их тела понижалась до +7°С.
П. И. Бахметьев мечтал добиться анабиотического состояния у высших млекопитающих — людей.
К сожалению, в 1907 г. между Бахметьевым и другими профессорами и управой Софийского университета возникли разногласия и его вместе с многими другими преподавателями уволили; при этом П. И. Бахметьеву пришлось продолжать свою работу, испытывая значительные материальные затруднения. Благодаря его огромной известности во всем мире в 1913 г. П. И. Бахметьев был приглашен на работу в Россию, где ему предоставили средства для создания института при Московском университете для изучения явления анабиоза. В марте 1913 г. П. И. Бахметьев прибыл в Одессу, а оттуда в Москву. Он предпринял поездку по многим русским городам, читал лекции по интересующим его проблемам, и прежде всего по проблеме анабиоза. К сожалению, здоровье этого крупного ученого уже было серьезно подорвано. В октябре 1913 г. П. И. Бахметьев, считавший Болгарию своей второй родиной, умер, прожив лишь полгода в родной стране.
Работы П. И. Бахметьева по проблемам анабиоза, обобщенные в нескольких значительных трудах, приобрели широкую популярность; один из них был опубликован в «Известиях Российской Академии наук» в 1902 г.
Еще в тот период, когда П. И. Бахметьев активно работал над проблемами анабиоза у насекомых, Макфедайн и Роуланд (1900 г.) провели опыты по воздействию низких температур на культуры тифозных и кишечных бактерий, дифтерийных палочек, бацилл сибирской язвы, образующих споры вибрионов азиатской холеры, стафилококков, протея, молочнокислых бактерий и других микроорганизмов. Культуры микробов, выращенных в твердой и жидкой среде, выдерживали 20 ч при температуре — 182°С, после чего их размораживали и исследовали. Было установлено, что ни одна микробная культура не потеряла своей первоначальной вирулентности т. е. при таком воздействии на микроорганизмы сверх низких температур они не погибали, а впадали в анабиотическое состояние. Больше того, опыты показали, что даже при температуре —252°С получаются те же результаты.
В 1909 г. русский ученый П. В. Бутягин замораживал при температуре от —20 до —44°С микроорганизмы вызывающие болезни у человека, и установил, что большинство из них сохраняет жизнеспособность в течение 3 месяцев.
В том же году Джекобе установил, что «воскрешение» коловраток зависит от ряда факторов. Он высказал предположение, что при полном высыхании коловратки не оживают. В тех случаях, когда они оживали, их теле сохранялись остатки влаги, и жизненные процессы продолжались, хотя и весьма замедленно. Подобное состояние коловраток граничило с полным отсутствием жизни.
Интересное сообщение сделали в 1911 —1912 гг. русские ученые В. Л. Омельянский и Б. Л. Исаченко. Они обнаружили вполне жизнеспособные микроорганизмы в замерзшей почве в зоне вечной мерзлоты.
В 1915 г. немецкий ученый Э. А. Шульц исследовал коловраток, тихоходок и нематод, высушенных на предметном стекле. При добавлении воды они быстро восстанавливали свою жизнедеятельность. Ученый установил что процессы, связанные с питанием и размножение» коловраток, при высушивании приостанавливаются. При гистологическом исследовании в их органах не были обнаружены изменения, а яйцеклетки находились в состоянии покоя. Исследователь сделал заключение, что жизнь коловраток может быть искусственно приостановлена и в любое время восстановлена.
Чтобы проверить, сохраняются ли процессы дыхания, высушенных коловраток, тихоходок и нематод подвергали воздействию низких температур при —253°С в течение 14 дней и при этом установили, что они снова оживают. Эти опыты подтвердили исключительную устойчивость перечисленных организмов, обитателей мхов и лишайников, не только к высушиванию, но и к воздействию на них очень низких температур, при которых процессы жизнедеятельности (включая и дыхание) невозможны.
В 1922 г. русский исследователь В. В. Ефимов, изучая переохлаждение и замораживание инфузорий, пришел к важному выводу, что причиной их гибели при замораживании является образование кристалликов льда в цитоплазме клетки и в коллоидной оболочке. Процесс замораживания фактически обусловил обезвоживание клеток, так как вода переходила в твердое состояние. Поэтому замерзание представляется своего рода высушиванием клеток организмов вследствие образования в них кристалликов льда.
В 1922 г. крупный специалист по анабиозу — русский ученый П. Ю. Шмидт высушивал животных на покровных стеклах на воздухе, после чего помещал их в пробирку с хлористым кальцием для полного высушивания. После этого коловраток переносили в пробирки с натрием. С помощью вакуумного насоса ученый выкачивал воздух до 0,2 мм ртутного столба и запечатывал пробирку. Высушенных таким способом коловраток он сохранял в течение трех месяцев, и после добавления воды часть из них оживала. В результате научно обоснованных оригинальных опытов Шмидту окончательно стало ясно, что коловратки, тихоходки и нематоды при высушивании сохраняют свою жизнеспособность, т. е. находятся в состоянии анабиоза. При этом они теряют свой первоначальный вид и превращаются в маленькие шарики.
В период с 1923 по 1926 г. австрийский ученый Г. Рам исследовал устойчивость коловраток, тихоходок и нематод к высыханию и низким температурам и установил, что эти организмы впадают в анабиотическое состояние не только при высушивании, но и при замерзании. Он помещал в трубочки высушенный на воздухе мох, содержавший коловратки, тихоходки и нематоды, выкачивал воздух с помощью вакуумного насоса и наполнял чистым азотом, водородом или гелием, запаивал их и сохранял в течение целого года. Когда после этого он извлек мох и смочил его, организмы в большинстве своем ожили. Чтобы доказать, что жизненные процессы в этих организмах полностью прекращаются, Г. Рам помещал высушенный мох на 20 месяцев в жидкий воздух при температуре —190°С или в жидкий гелий после постепенного охлаждения мха в течение 7 ч при температуре между —269 и 271,88°С. Через 10 дней он погрузил мох в воду, примерно через полтора часа находившиеся в нем коловратки, тихоходки и нематоды ожили.
Приблизительно в то же время французский ученый Поль Беккерель высушил семена различных растений (клевера, лютика, льна и др.) в вакууме при 40°С, запаял их в стеклянные пробирки, из которых выкачал воздух с помощью вакуумного насоса, и сохранял их в течение 4 месяцев, после чего поместил на 10 ч в жидкий гелий при температуре —269°С. Когда позже семена были посеяны, они взошли даже лучше, чем контрольные семена, хранившиеся в обычных условиях. Этот факт, объяснялся тем, что обычные семена хотя и очень слабо, но все же дышали, и связанные с дыханием процессы постепенно разрушали цитоплазму. Позже (1930 — 1936 гг.) Беккерель провел эксперименты со спорами папоротниковых и мхов. После того как их определенное время продержали при температуре —271°С, они прорастали и давали нормальные растения. Точно такими же устойчивыми оказались цветочная пыльца табака и растения львиный зев. После высушивания в течение 2 месяцев пыльца была подвергнута воздействию температуры от —269 до —271°С. Часть высушенной пыльцы исследователь сохранял в течение 5 месяцев в запаянных стеклянных пробирках. Пыльца прорастала, как только ее опускали в сахарный раствор, в то время как сохранявшаяся в течение такого же периода времени в обычных условиях пыльца погибала.
В 1928 г. советский ученый Н. Л. Сахаров, выясняя устойчивость гусениц озимой совки (Agrotis segetum) к холоду, пришел к выводу, что при температуре от —4° до —6°С не всегда наступает замораживание. Гусеницы обладали свойством не замерзать даже при температуре —11°С, если в их организме содержалось более 2,5% жиров и не меньше 11 % воды, содержащихся при нормальном состоянии.
Большой вклад в выяснение вопросов анабиоза у растений и причин их гибели внес советский ученый Н. А. Максимов, который в 1929 г. исследовал устойчивость растений к холоду. Он доказал, что гибель замерзших растений происходит не в период их переохлаждения, а после того как внутри них появляются кристаллики льда.
В природе многие обитатели замерзающих зимой водоемов вмерзают в лед. Весной после таяния льдов большая часть этих организмов оживает. В 1930 г., взяв пробу льда одного из подмосковных озер, советский ученый Н. В. Болдырев сумел после размораживания обнаружить 117 видов различных животных и растительных организмов. В числе этих видов ледовой фауны были главным образом представители пресноводных животных (коловратки, инфузории, ракообразные, моллюски, нематоды, ресничные черви и др.). После размораживания все эти животные очень быстро оживали. Так, например, коловратки и инфузории оживали буквально через несколько минут. В течение суток из 18 видов одноклеточных организмов оживали 13 видов, а из 14 видов коловраток оживали 9 видов.
Одним из видных исследователей в области анабиоза является советский ученый Н. И. Калабухов, который в 1933 г. в результате тщательно проведенных экспериментов сумел внести коррективы в некоторые неправильные выводы ученых, ранее изучавших анабиоз. Так, например, П. И. Бахметьев считал, что пчелы могут быть доведены зимой до состояния анабиоза путем замораживания. Н. И. Калабухов установил, что это невозможно, так как пчелы погибали уже при температуре чуть выше 0°С в связи с нарушением процесса питания. При таких температурах сахар не мог всасываться через стенки пищеварительного канала, и пчелы умирали от голода. Н. И. Калабухов провел опыты и с более высокоорганизованными животными — млекопитающими. Он повторил опыты П. И. Бахметьева с замораживанием летучих мышей и опроверг его утверждение, что этих млекопитающих можно полностью заморозить и затем снова оживить. Это могло произойти только в начальном периоде замораживания, когда замерзали лишь конечности и поверхностные ткани тела. Но как только начинали образовываться кристаллики льда во внутренностях тела, в легких, в кровеносных сосудах и сердце — животные погибали.
Советский ученый П. Н. Каптарев в 1936 г. сообщил, что при исследовании проб почвы в зоне вечной мерзлоты он сумел выделить значительное количество организмов (водорослей и спороносных микроорганизмов) и этим подтвердил проведенные до него исследования Омельянского и Исаченко.
Интересные исследования начал в 1938 г. американский биолог профессор Б. Лайет, который позже объединил свои усилия с другим ученым П. Гихеньо. Оба исследовали воздействие низких и сверхнизких температур на живые организмы, контролируя скорость их охлаждения. Сущность решаемой ими проблемы заключается в следующем. Известно, что существуют три агрегатных состояния тела — газообразное, жидкое и твердое. Твердое состояние, в свою очередь, разделяется на два состояния — кристаллическое и аморфное (стеклообразное). При переходе некоторых веществ из жидкого в твердое состояние их молекулы располагаются в строго определенном положении, образуя правильную геометрическую форму. Этот процесс называется кристаллизацией. Молекулы некоторых веществ в процессе перехода из жидкого в твердое состояние не выстраиваются правильно, а сохраняют такое же хаотическое положение, в каком они пребывали в жидком состоянии. Такую структуру имеет, например, обыкновенное стекло. Если охлаждение провести с большой скоростью (мгновенно), многие вещества могут вместо кристаллического перейти в аморфное состояние, причем их молекулы не будут иметь времени для того, чтобы разместиться в определенном порядке. Этот процесс затвердения в отличие от кристаллизации называется витрификацией. В определенных условиях аморфные вещества постепенно могут начать кристаллизоваться, что внешне выражается в их помутнении. Этот процесс называется девитрификацией. Он происходит всегда, когда аморфная масса медленно нагревается. Чтобы она перешла прямо из аморфного в жидкое состояние, нагревание необходимо проводить с очень большой скоростью. Оба ученых доказали, что при быстром охлаждении, при котором температура охлаждаемого тела снижается на сотни градусов в секунду, вода тоже может превратиться в аморфную массу, так и не образовав кристаллов. Они установили, что замерзающие живые организмы погибают вследствие медленного охлаждения, при котором в их телах образуются кристаллики льда. По этой причине разрушается цитоплазма. Если вода превратится в аморфную массу — такого разрушения не произойдет. После быстрого нагревания, проведенного так, чтобы не дать возможности воде кристаллизоваться, организмы снова оживают. Однако это
было сложной задачей из-за высокой скорости кристаллизации. Вот почему необходимым условием стало требование, чтобы толщина живых объектов не превышала 0,3 мм, причем содержание в них воды должно составлять не более 50%. При более высоком содержании воды толщина объектов должна быть еще уменьшена. В большинстве проведенных опытов объектами служили или одноклеточные организмы, или тонкие листья растений. Культуры из одноклеточных организмов наносили тонким слоем на поверхность пластинки слюды толщиной 0,01 мм. Пластинку погружали в жидкий воздух, где микроорганизмы мгновенно замерзали. Размораживание осуществляли, перенося объекты в нагретый до 40°С изопентан (жидкость, которая не смешивается с водой). При проведении некоторых опытов применялась нагретая ртуть, а при опытах с листьями растений и вода. Иногда объекты погружали даже в кипящую воду на 0,2 с, после чего немедленно переносили в холодную воду.
Весьма подходящий объект для опытов был найден американскими исследователями братьями А. и С. Гётцами в 1938 г. Они использовали обыкновенные дрожжи. С помощью кольца из платиновой проволоки они отделяли тонкую пленку с культурой дрожжей, при этом объект оказался достаточно тонким, чтобы его можно было охладить с большой скоростью. Погрузив пробу в изопентан при температуре –190°С, ее переносили в бензиловый эфир, подогретый до комнатной температуры. Таким образом осуществлялось быстрое размораживание. Затем к культуре добавляли каплю водного раствора красителя (метиленового синего), который окрашивал только мертвые дрожжи. Применяя такой способ, можно было под микроскопом пересчитать погибшие клетки, а их оказалось тем больше, чем медленнее проводилось замораживание и последующее размораживание. Это объясняется увеличением возможности кристаллизации воды в клетке. Время, которое дрожжи находились в замороженном состоянии, не оказывало влияния. При одних и тех же условиях замораживания и оттаивания количество погибших клеток и после сточасового, и после пятиминутного замораживания было одно и то же. При самых благоприятных обстоятельствах количество оживающих клеток достигало 20%. Разумеется, в природе такое быстрое охлаждение невозможно. Там всякое охлаждение сопровождается образованием льдинок, в теле организма.
В 1940 г. советский ученый А. Е. Крисе обнаружил спороносные и неспороносные микроорганизмы только на поверхности замерзшего слоя почвы.
В более поздних исследованиях (1948 г.) известный советский ученый П. Ю. Шмидт снова изучал анабиотическое состояние при замораживании, насекомых и некоторых животных с постоянной температурой тела. Он пришел к заключению, что в первый период после фазы переохлаждения не наступает полное замерзание организма, а начинают только появляться кристаллы в жидкостях и клетках организма. Следовательно, и анабиоз возможен только при условии, которое исключает полное замерзание всех клеток.
Позже, в 1949 г., А. Крисе вместе со своим соотечественником Т. Граве сообщил об исследованиях проб льда, полученных из зоны вечной мерзлоты, в результате которых установлено, что эти пробы не содержали микроорганизмов. По мнению исследователей, для окончательного выяснения вопроса о наличии микробов, находящихся в состоянии анабиоза в почве зон вечной мерзлоты, необходимы дополнительные опыты.
В 1947 г. советский ученый А. В. Каляев, соблюдая все правила асептики, исследовал ряд проб почвы, взятых в зонах вечной мерзлоты. Он установил, что пробы, полученные с больших глубин, содержали только спороносные микробы, а те, которые были взяты с более поверхностного слоя,— и неспороносные микробы. Исследования А. В. Каляева окончательно доказали, что микроорганизмы могут продолжительное время сохраняться в почве зоны вечной мерзлоты в анабиотическом состоянии.
Советский ученый Э. Я. Граевский за период с 1946 по 1948 г. подверг воздействию сверхнизких температур (—172°С) животные и растительные объекты, такие, как амебы, сперматозоиды (лягушек, крыс и собак), а также чешуйки лука и культуры микробов. Исследователь установил, что после воздействия низких температур сперматозоиды лягушек, чешуйки лука и культуры микробов сохраняли свою жизнеспособность. При очень низких температурах в клетках не образовывались кристаллы, так как их цитоплазма тотчас же переходила в аморфное состояние, минуя фазу кристаллизации благодаря мгновенному воздействию холода.
Интересные исследования над насекомыми при воздействии низких температур провел в 1955 г. советский ученый Л. К. Лозина-Лозинский. Проделанные им опыты показали, что при температуре —4,5°С далеко не все жидкости тела насекомых затвердевают. Кроме того, некоторые, хотя и очень слабые, процессы обмена веществ продолжают осуществляться даже и при более низких температурах. До этого почти все исследователи утверждали, что организм насекомых не способен выдержать полного замораживания, чтобы затем снова вернуться к жизни. Это объясняли его сравнительно сложным устройством. Опыты Л. К. Лозина-Лозинского доказали, однако, что даже и среди таких сложно устроенных организмов, как насекомые, возможны исключения. Он исследовал гусеницы кукурузной моли. Они оказались весьма устойчивыми по отношению к низким температурам. Эти гусеницы проводят зиму в полом стебле кукурузы и в естественных условиях могут выдерживать очень низкие температуры. Ученый поместил гусениц в сосуд с твердой углекислотой при температуре —80°С. Уже через 20 мин температура гусениц достигла —78,5°С, они стали совсем твердыми и, падая сверху в фарфоровую чашку, издавали звон, как будто превратились в стеклянные шарики. После того как охлаждение было прекращено, гусениц положили на вату и начали постепенно обогревать. 50% из них ожили. В другом опыте гусеницы находились несколько дней при температуре —30°С, а затем одни сутки при температуре —80°С. Часть из них тоже ожила. При таких низких температурах можно считать, что вся свободная вода в теле животных превратилась в лед. Едва ли можно предположить, что в них происходили какие-нибудь процессы обмена веществ. Однако этот вопрос нельзя считать вполне решенным, так как опытным путем было установлено, что у морозоустойчивых насекомых даже при температуре —20°С совершается какой-то, хотя и очень слабый, газообмен.
Как видно из приведенного исторического обзора, изучение этого интересного биологического явления занимало умы многих ученых начиная с начала XVIII в. и до наших дней.
Сегодня известно, что многие растительные и животные организмы при неблагоприятных условиях (замороженные или высушенные) существенно замедляют или даже полностью прекращают обмен веществ (3), развитие и размножение, но, несмотря на это, не погибают. При благоприятных условиях они снова восстанавливают процессы жизнедеятельности. В состоянии анабиоза живые организмы переносят сильный мороз и жару, высокое давление, глубокий вакуум, мощную радиацию, вибрации и т. п.